Comparando tecnologia alternativa de purificação de mAb

Por Jack Vicalvi, cientista principal, J2 Biopharm Associates LLC

Vimos mais melhorias no desenvolvimento de processos downstream nos últimos 15 anos do que ocorreram nos 35 anos anteriores. Esta é a primeira de uma visão geral em duas partes de produtos e abordagens inovadores selecionados com implicações universais que contribuíram com melhorias que permitem a fabricação de terapêuticas biológicas de moléculas grandes, como anticorpos monoclonais (mAbs) e vetores virais, com maiores recuperações e pureza.

Na Parte 1, examinamos como esses produtos mudam a forma como fabricamos mAbs, onde eles podem ser usados ​​nos atuais esquemas de desenvolvimento de processos e quais vantagens eles conferem em relação aos métodos anteriores. Abordamos a economia situacional que impulsiona o uso desses produtos ou abordagens inovadoras. Finalmente, nos concentramos em modelos de aumento de escala GMP para fins práticos: se não for escalável, não importa quão bom possa ser.

Diagramas de fluxo do processo mAb

A clarificação da colheita do biorreator é o primeiro passo no processo a jusante; não é o último passo do processo a montante, uma vez que é essencialmente uma purificação da substância medicamentosa. Esta etapa é crítica para a purificação eficiente do produto de interesse; a filtração de tamanho simples do material colhido é o método tradicional utilizado. No entanto, dependendo dos atributos críticos de qualidade (CQAs) necessários, a filtragem baseada no tamanho por si só pode não ser mais adequada ou inevitável.

O uso de dispositivos de filtração carregados (como os filtros 3M SP e ZB ou as membranas Millipore DOHC, COHC e XOHC) pode resultar na remoção antecipada de contaminantes altamente carregados, como o DNA da célula hospedeira (hcDNA) e algumas proteínas da célula hospedeira. (HCP) e vírus, melhorando significativamente a eficiência da captura downstream e, portanto, a recuperação inicial e a pureza. Em situações em que a viabilidade celular é baixa (<50%) durante a colheita, há um aumento acentuado nos restos celulares do hospedeiro, incluindo DNA, HCP (incluindo enzimas proteolíticas) e partículas virais intracelulares ou endógenas, onde uma redução adicional através de filtração por membrana carregada pode tornar-se significativo durante as etapas de purificação subsequentes. Em situações que envolvem baixa viabilidade celular, a adição de uma endonuclease, preferencialmente no biorreator, durante 1 hora antes da colheita serviria para reduzir o comprimento da cadeia de DNA e melhorar significativamente a filtrabilidade. A endonuclease continua a funcionar durante a clarificação até a captura (geralmente de 3 a 8 horas, dependendo das condições de captura e da velocidade de carregamento).

Na maioria dos casos, os mAbs não se ligam a matrizes aniónicas; no entanto, pode ser necessário ajustar o pH e/ou a condutividade da colheita (novamente, preferencialmente no biorreator), dependendo do alvo de interesse, para evitar a ligação ao filtro ou para preparar o alvo para captura em etapas subsequentes. As condições para a recuperação óptima do produto com redução máxima de contaminantes terão de ser determinadas empiricamente para cada mAb.

Quando filtros de profundidade de tamanho apropriado são selecionados, a centrifugação torna-se, na melhor das hipóteses, redundante; depois há o problema de questões de validação de ampliação e limpeza, mesmo com baldes descartáveis ​​(custos de equipamentos e manutenção de capital, geração de aerossóis e descarte de baldes usados). Nos casos em que a filtração é impraticável, o uso de cromatografia em leito expandido poderia ser uma opção mais viável e econômica (veja a tecnologia Rhobust EBA da Upfront).

Tipicamente, a etapa de captura empregará uma resina de Proteína A. No entanto, nem todas as porções de Proteína A são criadas iguais. Alguns ligam diferentes mAbs com vários graus de especificidade e avidez; portanto, qualquer resina de proteína A escolhida deve ser determinada empiricamente. Além disso, há a matriz de resina a ser considerada; estes incluem resinas macias, como agarose e alguns metacrilatos, e resinas rígidas, como poliestireno ou cerâmica. Todos possuem extensos arquivos regulatórios.

As principais diferenças entre resinas macias e rígidas estão na velocidade linear e no consumo de tampão durante a operação. A agarose é uma resina macia que requer suporte de parede ou o leito cede, formando um “sorriso” que produz uma borda frontal durante a eluição em colunas com largura superior a 5 cm. Também é um meio de difusão lenta e perde capacidade e integridade do leito acima de 300 cm/h. Além disso, devido à sua natureza difusiva, requer lavagem extensa durante as trocas de tampão, especialmente antes da eluição. As resinas Capto são agarose reticuladas, o que pode aliviar alguns desses problemas; no entanto, a matriz base ainda é agarose, necessitando de lavagem extensa e taxas de fluxo lentas para permitir a difusão. As resinas rígidas são mais fáceis de embalar, requerem muito menos lavagem e mantêm a integridade do leito sem suporte de parede. Estas resinas também podem ser operadas a velocidades lineares de 800 a 1.200 cm/h sem perda significativa de produtividade.